Qələvi Proteaz

Tətbiq və prinsip

Bu qələvi proteaz, PC bölmələri şəklində ifadə olunan, Bacillus subtilis var-dan alınan preparatların proteaz aktivliyini təyin etmək üçün istifadə olunur. və Bacillus licheniformis var. Analiz kazeinin 37 ° və pH 7.0-da 30 dəqiqəlik bir proteolitik hidrolizinə əsaslanır. Hidroliz olunmamış kazein filtrasiya yolu ilə çıxarılır və həll olunan kazein spektrofotometrik olaraq təyin olunur.

Alkalin Proteazın Reaktivləri və Çözümləri
Kazein Hammarsten dərəcəli kazein istifadə edin (Amerika Birləşmiş Ştatları Biyokimyəvi Corp, Kataloq No. 12840 və ya ekvivalent).
Tris Tampon (pH 7.0) 12.1 g ferment dərəcəli (və ya ekvivalent) tris (hidroksimetil) aminometanı 800 mL suda həll edin və 1 N xlorid turşusu ilə pH 7.0-a titrləyin. 1000 ml həcmli bir kolbaya köçürün, su ilə həcmdə seyreltin və qarışdırın.
TCA Solüsyonu 18 ml trikloroasetik turşu və 19 g sodyum asetat trihidratı 800 ml suda 1000 ml həcmli bir kolbada həll edin, 20 ml buzlaq sirkə turşusu əlavə edin, su ilə sulandırın və qarışdırın.
Substrat məhlulu 6.05 g ferment səviyyəli tris (hidroksimetil) aminometanı 500 ml suda həll edin, 8 mL 1 N xlorid turşusu əlavə edin və qarışdırın. Bu məhlulda 7 q kazein həll edin və ara sıra qarışdıraraq 30 dəqiqə qaynar su banyosunda qızdırın.
Otaq istiliyinə qədər soyudun və kazein çökməsinin qarşısını almaq üçün güclü bir qarışdıraraq yavaş-yavaş turşu əlavə edərək 0.2 N xlorid turşusu ilə pH 7.0-a düzəldin. Qarışığı 1000 ml həcmli bir kolbaya köçürün, su ilə həcmdə seyreltin və qarışdırın.

Nümunə hazırlanması Tris Tamponundan istifadə edərək nümunə ferment preparatının həllini hazırlayın ki, 2 ml son seyreltmə 10 ilə 44 bakteriya proteaz vahidi arasında olsun.

Qələvi Proteaz Proseduru
Hər bir ferment testi üçün bir tüp, hər bir ferment boşluğu üçün bir tüp və substrat boşluğu üçün bir tüp imkan verərək 25- 150 mm-lik bir sıra test tüplərinin hər birinə 10.0 mL Substrat Solüsyonunu pipet edin. Boruları 37 ° ± 0,1 ° -də saxlanılan su banyosunda 15 dəqiqə bərabərləşdirin.
Saniyəölçənə sıfır vaxtdan başlayaraq, sürətləndirin Nümunə hazırlanmasının 2.0 mL-ni tarazlaşdırılmış substratın içərisinə. Qarışdırın və su banyosundakı boruları dəyişdirin. Substrat boşluğuna 2 ml Tris Tamponu əlavə edin (Nümunə Hazırlanması əvəzinə). Tam 30 dəqiqədən sonra reaksiyanı dayandırmaq üçün hər ferment inkubasiyasına və substrat boşluğuna 10 ml TCA Solüsyonu əlavə edin. Zülalın tamamilə laxtalanmasına imkan vermək üçün boruları su banyosunda əlavə 30 dəqiqə qızdırın.
İkinci istilik dövrünün sonunda hər bir boruyu güclü bir şəkildə silkələyin və 11 sm-lik Whatman No. 42 və ya ona bərabər tutulan filtr kağızı ilə süzün, ilk 3 ml filtratı atın.
[Qeyd: Filtrat tamamilə aydın olmalıdır.]
Alətini sıfıra qoymaq üçün substrat boşluğundan süzüntü istifadə edərək, uyğun bir spektrofotometr ilə 1 sm hüceyrədə 275 nm-də hər bir nümunə filtratın udma qabiliyyətini təyin edin. Müvafiq ferment boş oxu çıxarılaraq hər oxunuşu düzəldin və AU olaraq alınan dəyəri qeyd edin.

Əvvəllər sabit çəkidə qurudulmuş 100.0 mq L-tirozin, xromatoqrafik dərəcəli və ya ekvivalent (Aldrich Chemical Co.), 1000 ml həcmli bir qaba köçürmə. 60 mL 0.1 N xlorid turşusunda həll edin. Tamamilə həll edildikdə, məhlulu su ilə sulandırın və hərtərəfli qarışdırın. Bu məhlul 1.0 ml-də 100 ig tirozin ehtiva edir. Bu stok məhlulundan üç ml daha seyreltmə hazırlayın ki, ml başına 75.0, 50.0 və 25.0 µg tirozin olsun. Dörd məhlulun 0,006 N xlorid turşusuna qarşı uyğun bir spektrofotometrdə 1 sm hüceyrədə 275 nm-də udma qabiliyyətini təyin edin. Tirozin konsentrasiyasına qarşı bir udma sahəsi hazırlayın.

Qələvi Proteazın Hesablanması
Bir bakterial proteaz vahidi (PC), analiz şəraitində dəqiqədə 1,5 µg / mL L-tirozin ekvivalenti istehsal edən ferment miqdarı olaraq təyin olunur.
Standart əyridən və interpolasiya yolu ilə, tirozin konsentrasiyası 60 ug / ml olan bir məhlulun udma qabiliyyətini təyin edin. 0.0115-ə yaxın bir rəqəm alınmalıdır. Tirozin konsentrasiyası 1,5 µg / mL olan bir məhlulun ekvivalentliyini əldə etmək üçün interpolyasiya edilmiş dəyəri 40-a bölün və bu şəkildə AS olaraq çıxarılan dəyəri qeyd edin.
Nümunə ferment preparatının aktivliyini tənliklə hesablayın

PC / g = (AU / AS) × (22 / 30W)

22-də reaksiya qarışığının ml-də son həcmi olduğu; 30, reaksiyanın min dəqiqəlik vaxtıdır; və W - götürülmüş orijinal nümunənin g-dəki çəkisi.

Qələvi Proteazın qablaşdırılması və saxlanması

Qatı qida qablaşdırma torbası, 25 kq / barel.

Qələvi Proteaz quru, sərin və yaxşı havalandırılan yerlərdə günəşdən, istidən uzaqda saxlanılmalıdır.

Ödəniş :T / T, Paypal, Western Union, Alibaba Ticarət Zəmanəti, VISA, MasterCard, e-Checking, Sonra Ödənin, LC və s.